CGT器械報告：需求激增，釋放巨大市場潛能（上）-全球速訊

細胞治療是指將正?；蚪涍^生物工程改造過的人體細胞移植或輸入患者體內，從而達到治愈患者的技術。根據治療時所用到的細胞種類進行分類可以分為：干細胞療法和免疫細胞療法。

干細胞治療是把健康的干細胞移植到患者體內，以達到修復或替換受損細胞或組織，從而達到治愈的目的，可以應用于神經系統疾病、免疫系統疾病和外科疾病。據統計全球范圍內曾經獲準上市的間充質干細胞產品有18款，其中符合藥品定義的有10款，主要適應癥為骨修復。

免疫細胞治療是指從患者體內分離出免疫細胞，經過體外處理后再回輸到患者體內，識別腫瘤細胞并進行選擇性殺傷，起到治療腫瘤的作用。按照免疫細胞是否經過基因工程改造可分為兩大類：未經改造的主要包括調節性T細胞（Treg）、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。經基因工程改造的主要包括嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）、T細胞受體T細胞（TCR）、嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）。

細胞治療經過數年的研發和臨床試驗，現已進入快速發展期。2017年以CRA-T為代表的細胞治療產品獲批上市，進一步激發了藥企對于細胞治療領域的投入。

來源：PubMed，貝殼社作圖

圖表數據為PubMed網站有關細胞治療文章的歷年收錄情況，從數據趨勢上可以看出學術界對于細胞治療的關注度在逐年上升。弗若斯特沙利文數據預測2020年到2025年間CAR-T治療的市場規模增速將達到53%。

來源：沙利文

根據弗若斯特沙利文數據預測國內細胞治療市場規模自2021年開始將維持快速增長的勢頭，預計到2030年國內細胞治療的市場規模將達到584億人民幣。市場規模增加也加大了對于上游試劑耗材的需求，預測到2030年試劑耗材的市場規模將達到204億人民幣。

來源：沙利文

細胞治療產品的生產過程可以分為質粒制備、病毒制備和細胞工藝流程三大部分。

質粒是用于制備病毒載體的原材料，在三質粒轉染體系中包含一個穿梭質粒、一個包膜質粒和一個包裝質粒。穿梭質粒帶有所需要的外源目的基因，包膜質粒和包裝質粒上帶有用于病毒生產的基因。將上述三個質粒共同轉入宿主細胞中后可以產生出包裹著目的基因的病毒。再用得到的病毒去侵染目的細胞，通過這樣的方式就可以將目的基因整合到宿主細胞的基因組中，在CAR-T治療體系中，就是通過病毒載體將CAR基因轉入T細胞中。

質粒是一種存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子，也是目前細胞治療過程中最重要的工具之一，可以在體外轉染改造靶細胞，或在體外多質粒共轉染細胞產生病毒載體。目前質粒DNA的生產一般基于在大型不銹鋼生物反應器中使用大腸桿菌發酵的方法，盡管質粒的GMP生產技術相對成熟，但商業化大規模生產仍具有較高的技術壁壘。質粒生產流程涉及質粒構建、菌株庫構建、發酵及純化等多個步驟，生產流程長、過程復雜難控、容錯率低，操作不當會使得整批產品報廢。這一階段所需的時間在7-10天。

利用質粒能夠與細菌共存的這一特點，可以將質粒導入大腸桿菌中，讓質粒的數量隨著大腸桿菌的增殖而同步增加。大腸桿菌在合適的生長條件下，每20分鐘就可以繁殖一代，同時擴增過程中可以選擇不含有動物源成分的培養基，可以減少一部分質控的步驟。

為了保證下游產品的穩定性，所以在質粒的生產過程中會采取生產體系放大的工藝，以保證在一次生產流程中得到足量的產物。放大工藝中需要用到生物發酵罐。

大腸桿菌擴增完成后需要將其從培養體系中分離，常用的方式有離心和中空纖維切向流過濾。離心適用于實驗室的生產模式，在大規模生產體系中不具有效率優勢。中空纖維切向流過濾，也稱錯流過濾，進樣液流平行于膜表面，部分料液穿過膜（濾液），其余料液（回流液）循環回到進樣容器。這樣的液體過濾方式可以防止分子在膜表面聚積而造成堵塞，維持過濾體系的整體效率。

大腸桿菌的裂解方法有很多，常用的是堿裂解法。在堿性條件下，大腸桿菌的蛋白質、RNA、宿主DNA和質粒釋放到溶液中并變形，大量變性的蛋白質和宿主DNA被沉淀，而質粒由于分子量較小，很容易復性。

大腸桿菌裂解的過程中會使用到大量的液體試劑，會使裂解液體積增加，在層析純化前進行濃縮和洗濾，不僅可以大大減小樣品體積，還可以有效去除RNA、色素和部分宿主蛋白、宿主DNA等雜質，少層析階段的負荷。

基于成本考慮在澄清步驟中會采用CaCl2絮凝及NH4HCO3沉淀的方式，通過深層過濾以及除菌過濾得到澄清料液。對于質粒的超濾濃縮，一般按照如下標準進行 NWMC（GE 中空纖維）的選擇，中空纖維的低剪切力特點可以有效保護質粒的超螺旋構象。

貝殼社整理

裂解液經過超濾濃縮后，樣品中主要雜質有RNA殘留、開環DNA和內毒素。針對這三種雜質，可以通過三步層析一一除去達到純化的目的。

第一步采用凝膠過濾層析，該步的目的是除去大量RNA殘留。高濃度硫酸銨（≥1.5 M硫酸銨）的平衡液使RNA和質粒的空間大小的差異性達到了最大，RNA可以進入凝膠顆粒內部，所以流速較慢，而質粒通過層析柱的外水體積首先流出。本步層析以后，質粒已經達到了很高的純度，瓊脂糖凝膠電泳幾乎看不到RNA雜帶。

第二步采用親和層析，主要目的是去除開環質粒。經過凝膠過濾質粒已經被置換到高濃度硫酸銨的緩沖液中，可以直接上樣至親和層析柱。在此條件下開環質粒和超螺旋質粒均與層析柱結合，上樣結束后，首先用2.0M硫酸銨的緩沖液沖洗層析柱可以將開環質粒洗脫，隨后使用含有1.7M硫酸銨和0.3M氯化鈉的緩沖液將超螺旋質粒洗脫，實現開環質粒和超螺旋質粒的分離。

第三步采用陰離子交換層析，主要目的是去除內毒素。其主要來源為大腸桿菌，是質粒一個重要風險雜質。商用的無內毒素質粒抽提試劑盒，其內毒素能達到的標準只有<100EU/mg質粒。質粒帶有高密度的負電荷，可以在高鹽濃度下與強陰離子交換填料結合，而內毒素在此高鹽情況下不與填料結合，從而實現去除內毒素的效果，此步驟處理后內毒素含量可以降至<1EU/mg。

層析分離后，樣品在所選緩沖液中濃縮和洗濾。操作與層析前切向流過濾的條件大致相同。而對于除菌過濾，由于終產品較大的尺寸和高黏度，且可能對剪切力敏感，會有額外的挑戰，一些關鍵的考量因素包括鹽濃度、膜類型、pDNA純度以及如何定義過濾終點等。

病毒載體的表達生產是細胞治療藥物研發的核心。通常病毒載體的生產涉及上游的載體表達和下游的分離純化。載體的生產涉及十分復雜的工藝，難度極高，且制備周期較長，同時GMP生產涉及復雜的生產體系和嚴格的質量控制體系，這直接導致了全球范圍內的病毒載體GMP產能接近瓶頸。這一階段所需的時間在2-3周。

病毒自身不具備擴增的能力，所以它的擴增方法需要依賴于宿主進行。目前常用的宿主細胞為HEK293T，該細胞的增殖能力和轉染效率都要高于HEK293細胞系，同時可以在無血清的培養基中懸浮生長，這個特性對于大規模載體生產非常有利。將病毒質粒轉入細胞后，借助細胞內的表達體系完成對病毒的生產。

為了能夠大規模生產病毒，在貼壁培養體系中會用到大量的多層培養系統(Cell Factories(CF))或者Cell Stacks(CS)。

傳統上采用10-24個CF-10設備，一個生產周期可以收獲的體積介于20-52升。但是這種方法屬于開放體系生產，存在較高的污染風險。為了降低污染風險，可以采用封閉的全自動培養體系中空纖維的慢病毒生產系統，首先將HEK293T接種到中空纖維生物反應器中（HF），待細胞貼壁24小時后將質粒轉染進HEK293T細胞，產量與3個CF-10疊層相當。

雖然轉染貼壁細胞是生產慢病毒的金標準，但是這個方法在大規模生產上游諸多限制。對工業化生產來說，在大的生物反應器中培養細胞通常是最便捷的方式。在懸浮培養體系下，細胞可以通過不同的容器進行擴大：搖瓶、不銹鋼生物反應器、培養袋及一次性攪拌容器。其中波浪式一次性生物反應器的體系可以達到50L的生產規模。

經過質粒轉染之后的細胞會將生產出來的病毒釋放至培養基中，由于是大體系的生產模式，實驗室采用的離心分離方式已不再適用，所以這一步分離是基于膜和色譜技術的過濾，過程步驟的組合是可變的。主要包括三個階段：1）從粗制或澄清細胞培養物中初步純化捕獲目標載體，并消除主要污染物；2）中間純化處于捕獲和精純階段之間，主要去除特定的雜質（蛋白質、DNA 和內毒素）；3）最后是精純，旨在去除痕量和雜質，以適合制劑的形式產出活性產品。

這一步中使用Frontal filtration 0.45μm的過濾體系進行過濾，來去除細胞和細胞碎片等雜質。

使用切向流過濾/超濾或者體積排阻色譜法來對病毒進行濃縮，濃縮后樣本的體積減小，這時可以采用超速離心的方式對病毒進行純化。

大多數操作規程的滅菌步驟是采用0.2μm的膜過濾。這是在GMP條件下降低最終產品微生物污染風險的標準法規要求。該操作必須在符合Class100(美國)或Grade A(歐盟)標準的環境內進行。

現階段用于細胞治療的細胞來源還是以患者提供為主，這就需要從患者體內采集用于后續改造的細胞。比如用于CAR-T、TCR-T治療的T細胞，NK細胞等。這一階段所需的時間在10-15天，以下步驟是基于CAR-T細胞治療流程進行描述。

使用外周血采集的方式從患者體內獲得全血樣本，隨后采用Ficoll密度梯度離心法從全血中分離得到外周血單個核細胞（PBMC）。為了從PBMC中分離得到T細胞，可以采用磁性分選技術（MACS）分離，這個過程中將會使用到CD3/CD28抗體偶聯磁珠，以及磁力分選儀。

分離得到的T細胞通過TCR/CD3復合物和共刺激CD28受體 (實現最佳T細胞活化所必需的) 接收激活信號。同時在IL-2存在的情況下，T細胞開始增殖。隨后用病毒載體對T細胞進行修飾，最終的轉染效率可以通過檢測處理后細胞的熒光表達水平來確定。

為了達到治療效果，經過修飾后的T細胞還需要經過體外擴增的步驟。修飾過的T細胞將會被轉移到一次性封閉式細胞培養袋中，放置在一次性生物反應器上進行大規模增殖，通過自動灌流方案提高細胞密度，同時可以實時監控反應體系的運行狀況。

擴增后的細胞不能直接用于治療，還需要經過濃縮分裝等步驟。簡單來說是使用細胞處理儀把T細胞的濃度增加到1X1010/50ml（不同品牌儀器建議的細胞濃度存在差異）。向濃縮后的細胞中加入成分為 PLASMALYTE A 含有50% CryoStor? CS10 (BioLife Solutions) 和 5% human serum albumin的凍存液，隨后分裝到細胞凍存袋中。

細胞的凍存采用梯度降溫的方法，降溫速度設定為每分鐘下降1攝氏度，直到溫度下降至-100攝氏度，隨后將細胞轉入液氮中保存。復蘇時常采用干式細胞復蘇儀，可以詳細記錄復蘇時的數據，同時避免傳統水浴復蘇過程中可能出現的污染風險。

首先用于質粒、病毒和細胞處理的生產環境需要符合GMP規范，2019年11月，NMPA食品藥品審核查驗中心發布《GMP附錄-細胞治療產品》（征求意見稿），是國內首部針對細胞治療產品的GMP附錄，對細胞治療產品的生產質量控制做出明確規范。該附錄中，要求“細胞治療產品、病毒載體和質粒的生產應當分別在各自獨立的生產區域進行，并配備獨立的空調凈化系統”，以此防止交叉污染。同時GMP規范要求陽性供體材料（常見于自體療法，異體基本不存雜）的生產操作應在獨立的專用生產區域進行，對密閉系統、隔離器和隔離貯存同樣作出要求。

來源：中信證券：細胞治療裝備耗材行業專題研究報告

無菌隔離技術分為潔凈室、限制進出屏障系統（RABS）、隔離器3大類。潔凈室將操作人員、操作環境和操作對象混在一個空間，人員安全與樣品污染風險大，維護成本高，驗證困難。RABS通過物理隔斷將A級、B級區區分開；RABS可分為主動與被動式，開放式（ORABS）與封閉式（CRABS）；生產時部分可開門干預（CRABS不可以），最低放置于B級區。隔離器采用完全密閉的系統將生產空間與周圍環境完全隔離，并配備相應的空氣處理單元及過氧化氫滅菌裝置，具有最高的安全性，可放置于D級區。

細胞培養隔離器可以為細胞治療企業打造細胞藥物柔性制造平臺，集成細胞藥物制備所需的關鍵儀器設備，實現分離提取、誘導活化、擴增培養、換液、收集等全站功能，使得從細胞藥物研發到細胞藥物GMP生產無縫連接，最終實現全過程的密閉化操作，避免了生產過程中的交叉污染并降低了生產耗時和細胞損耗，并減少了安裝和運行成本。目前國內細胞培養隔離器正處于萌芽階段，主要的國產供應商是東富龍、泰林生物、森松國際、楚天科技等。

質粒和病毒的制備工業上基本類似，可以分為擴增和純化兩個階段，其中使用到的設備耗材類型也高度重合，只是在使用時選擇的組合方式以及產品規格上存在差異。

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一次性生物反應器主要有搖動式、波浪混合式和攪拌式，其中搖動式、波浪混合式體積相對較小，攪拌式反應體積則較大，目前最大的一次性反應器由ABEC開發，體積達到6000L。國外企業中思拓凡、賽多利斯、美天旎和Lonza，國內企業中東富龍、華龕生物、中博瑞康、楚天科技和金儀盛世等都有在生物反應器制造方面的布局。

一次性反應袋是與反應體系直接接觸的耗材，其生產的壁壘在于原材料多層共擠膜的生產和焊接工藝。體積越大的一次性反應袋對膜和工藝的要求也就越高，這也是目前一次性反應體系體積受限的主要原因。目前國內多層共擠膜薄膜原材料主要生產企業是石四藥集團，由子公司博生醫用新材料公司（江蘇）生產，一次性反應袋的生產企業主要有樂純生物、多寧生物、金儀盛世等公司，此外楚天科技等已經在加速布局。

一次性反應系統主要由一次性反應器（包括反應袋）、一次性儲液袋和一次性過濾組件等共同組成，從成本占比來看，一次性反應器占比約為50%，一次性儲液袋和反應袋等占比約為40%，是一次性反應系統成本占比最高的兩項?？傮w來看，一次性反應系統的技術壁壘在于反應袋、儲液袋等的設計。一次性反應袋的價格和體積成正相關：

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層析柱生產企業主要有GE、Millipore、Pall、Repligen和賽多利斯等少數幾個企業，產品均可用于試驗階段和大規模生產階段。對比來看，GE的產品種類較多，在全球處于領導地位，市場份額也最大。層析柱最重要的幾個品質是重現性、壽命和選擇性，其涉及到柱子本身的原材料選材、鍵合工藝、裝柱工藝和出廠質量檢測等多個環節，整體來說，層析柱研發生產壁壘相對較低，國內企業如月旭科技、納微科技等企業均已經實現突破。

過濾膜在工藝過程中可以起到除菌、濃縮以及除去內毒素的作用。過濾膜的孔徑大小決定了其具體的功能。

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超濾膜的性能通暢是指膜的物化性能和分離透過性能。物化性能主要包括膜的機械強度、耐化學藥品、耐熱溫度范圍和適用PH范圍等，分離透過性能主要指膜的水通量和切割分子量及截留率。海外的超濾膜生產企業主要有Millipore（Merck）、Pall 、賽多利斯、GE等少數幾個企業，國內企業主要是科百特。

細胞培養基，目前用于細胞培養的培養基有四類，含血清培養基、無血清培養基、無動物來源和成分的培養基以及化學合成的培養基?？偟膩砜?，CGT需要對細胞系培養（如生產慢病毒）和對原代細胞培養（自體CAR-T），后者細胞更為敏感，也需要選用特定培養基。

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全球主要的培養基供應商包括Gibco（賽默飛）、Hyclone（Cytiva，丹納赫旗下）、Sigma-Aldrich（默克）等。在CDMO公司中，Lonza已擁有一流的培養基技術和供應能力，尤其在CGT領域，其X-VIVO15無血清培養基專為免疫細胞培養設計，化學成分明確，不含外源生長因子等，近年來廣泛應用于細胞治療產品。

免疫磁珠，磁珠（beads）是CGT領域的重要試劑，供應為外資壟斷。磁珠在CGT領域有著廣泛的應用，可用于細胞分選、免疫識別、核酸分離、蛋白純化等流程。而在CAR-T生產中，磁珠一方面可用于T細胞的分選，另一方面包被CD3/CD28單抗的磁珠常用于T細胞的激活擴增，與直接使用單抗的白細胞介素相比，磁珠方便激活后的分離，更易操作，且激活效率更高，產品表現穩定。

在磁珠供應方面，市場基本為外資壟斷，處于第一梯隊的企業包括德國美天旎、賽默飛等。其中賽默飛的Dynabeads磁珠被廣泛應用于CAR-T生產中的T細胞激活。根據賽默飛官網報價，Dynabeads FlowComp 人CD3試劑盒（用于分離CD3+ T細胞）的單盒（80ml全血或2*10^9 PBMC）報價達1.5萬元，而用于T細胞擴增與激活的Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 2ml價格高達9414元。在CAR-T臨床或商業化生產中，磁珠是生產成本的重要組成部分，有望通過規?；档拖鄳杀?。

細胞治療的成本可以劃分為設備和耗材兩部分。目前已獲批上市的細胞治療產品定價折合人民幣均在百萬級別。一方面是因為前期高昂的研發投入，另一方面是復雜的生產過程以及對試劑耗材高標準的要求。

以用于慢病毒包裝質粒為例，符合GMP生產要求的質粒DNA每克的價格達數萬美元。商業化生產規模下，不同生產工藝中的質粒DNA成本占生產成本的18%~46%。不僅如此，根據文獻中統計的數據顯示目前不同技術路線下病毒的總回收率最高僅為40%，這就導致在生產過程中需要放大生產規模來保證病毒的最終產量。所以在CAR-T細胞治療試劑耗材的成本中，慢病毒的占比達到了66%。

來源：Google scholar

在設備方面以海外Prodigy產線為例，生產線所用的主要儀器設備如下表所示：

來源：Google scholar

單價較高的設備主要是高壓滅菌器、隔離器和Prodigy。其中Prodigy是生產的核心設備，它能夠全自動完成對T細胞的分選、激活、轉導、擴增、制劑、凍存等步驟。通過標準化程序自動控制的方法，配合密閉的無菌管道完成各種復雜的細胞操作，有效避免了人工操作過程中可能出現的失誤和污染風險，極大地提高實驗效率，保證GMP級細胞制備的可重復性。